Genetiska sjukdomar är fortfarande en global utmaning, eftersom de orsakas av mutationer i gener som påverkar de biologiska funktionerna, metaboliska processerna eller produktionen av vissa essentiella proteiner hos individer, till olika ärftliga sjukdomar. Genterapiläkemedel är en typ av terapeutisk intervention som riktar sig mot specifika gener, som syftar till att reparera eller modifiera dem, och ger nya instruktioner för celler att producera funktionella proteiner eller ingripa i de gendefekter som orsakar sjukdomar.
Till de vanliga genläkemedlen hör främst DNA och RNA, där DNA kan vara genfragment eller gensekvenser med terapeutisk effekt. Dessa DNA levereras till celler för att ersätta eller komplettera de defekta eller saknade genfunktionerna. RNA kan vara budbärar-RNA (mRNA), litet interfererande RNA (siRNA) eller antisensoligonukleotider (ASO), etc., som kan användas för att modifiera, hämma uttrycket av skadliga gener eller återställa funktionen hos specifika gener.
Men både DNA och RNA står inför många utmaningar från att komma in i människokroppen till att nå målcellerna. Eftersom gensekvenser är instabila i mag-tarmkanalen administreras de vanligtvis genom intravenös eller subkutan injektion, men trots det bryts de flesta av gensekvenserna fortfarande ned av de rikliga nukleaserna i människokroppen.
När en liten mängd återstående genläkemedel når utsidan av målcellerna kan de inte komma in i cellerna eftersom gensekvenser är stora molekyler med fosfatgrupper som bär negativa laddningar, medan cellmembran också bär negativa laddningar. När två negativa laddningar möts stöts generna bort och kan inte komma in i cellerna. Därför måste vi utveckla specifika genläkemedelstillförselmetoder för att förhindra deras nedbrytning in vivo och förbättra effektiviteten av cellmembranpenetration, och leverera DNA- eller RNA-sekvenser till cellerna smidigt.
Leveransmetoder för gendroger
De nuvarande vanliga genleveransmetoderna är huvudsakligen indelade i två kategorier: viral vektorleverans och icke-viral vektorleverans. Viral vektorleverans inkluderar huvudsakligen adeno-associerat virus (AAV) och lentivirus, etc., som kan simulera processen för virusinfektion av värdceller och enkelt korsa cellbarriärer, och därmed uppnå hög leveranseffektivitet. Men leverans av viral vektor har också problem: för det första har den begränsad förpackningskapacitet, såsom AAV:s maximala förpackningskapacitet är 4,7 kb, vilket inte kan leverera längre gensekvenser; för det andra kan virala vektorer orsaka allvarliga immunreaktioner, inklusive cellulär immunitet och humoral immunitet, vilket utgör risker för kliniska tillämpningar. Jämfört med det har icke-virala vektorer enorma fördelar när det gäller säkerhet och läkemedelsladdningskapacitet.
De nuvarande vanliga icke-virala vektorerna inkluderar huvudsakligen liposomer, polymerer, nanopartiklar, exosomer, etc., bland vilka liposomer är vesiklar som bildas av amfifila molekyler med diametrar från 100nm till 1um. De består huvudsakligen av fosfolipider, kolesterol, PEG-lipider och katjoniska lipider. Fosfolipid-bilagerstrukturen liknar cellmembran och kan komma in i celler smidigt genom endocytos. Dessutom kan liposomer också modifiera PEG eller specifika antikroppar på deras ytor för att undkomma kroppens immunförsvar samtidigt som de riktar in sig på specifika vävnader eller celler. Katjoniska liposomer är liposomer som innehåller positivt laddade kvartära ammoniumsaltlipider, som bättre kan binda med negativt laddade nukleinsyraläkemedel och bibehålla stabiliteten i leveranssystemet. Därför är liposomer en av de vanliga icke-virala vektorleveransmetoderna för genläkemedel.
Men traditionella liposomer har också vissa problem: först och främst, på grund av det stora intervallet av liposomdiametrar, även om detta kan säkerställa tillräcklig läkemedelsladdningskapacitet, när liposomer passerar genom det vaskulära endotelgapet (100-200nm), kommer för stor storlek att hindra denna process. Dessutom, efter att liposomer kommer in i celler genom endocytos och bildar endosom-lysosomsystem, kan traditionella liposomer inte slutföra lysosomala flykt i tid, vilket resulterar i att de flesta genläkemedel bryts ned av lysosomer och inte kan utöva sina effekter. Baserat på dessa brister hos traditionella liposomer när det gäller att leverera genläkemedel, har lipidnanopartiklar (LNP) utvecklats och blivit en viktig leveransmetod speciellt lämplig för att leverera nukleinsyror till målceller och vävnader.
Introduktion till LNP Carrier System
Lipidnanopartiklar (LNP) är nanopartiklar som består av -lipidliknande ämnen och en diameter vanligtvis mellan 10-200 nm. Jämfört med traditionella liposomer är de mindre och lättare att passera genom vaskulära endotelgap. Dessutom består LNP vanligtvis av katjoniska/joniserbara lipider, hjälpfosfolipider, polyetylenglykol (PEG) lipider och kolesterol. Bland dem kan extra fosfolipider och kolesterol öka stabiliteten hos LNP; PEG-lipider hjälper till att öka cirkulationstiden för LNP in vivo och minska immunreaktioner. Dessa komponenter har liknande funktioner som traditionella liposomer. Skillnaden ligger i de katjoniska/joniserbara lipiderna, som också är huvudområdet för patentskydd för LNP.
Som nämnts tidigare kan katjoniska liposomer effektivt bibehålla bindningen med nukleinsyraläkemedel och förbättra leveranseffektiviteten för nukleinsyraläkemedel. Katjoniska liposomer är emellertid också benägna att binda icke-specifikt till negativt laddade plasmaproteiner, blodkroppar etc. i kroppscirkulationen, vilket orsakar liposomaggregation och rensas snabbt ut ur kroppen (halveringstiden för katjoniska liposomer in vivo är bara 15 minuter).
För att lösa detta problem har forskare utvecklat en ny typ av lipidmaterial som kallas joniserbara lipider. Joniserbara lipider påminner mycket om katjoniska lipider till sin struktur. Om man tar den vanliga katjoniska lipiden DOTAP och den joniserbara lipiden DODAP som exempel, är skillnaden att DOTAP är ett kvartärt ammoniumsalt med en positiv laddning, medan DODAP är en tertiär aminstruktur. Den tertiära aminstrukturen kan hålla lipidens pKa mellan 6-7. När pH är lägre än pKa (under sura förhållanden) är joniserbara lipider positivt laddade.
När pH är nära pKa (under neutrala förhållanden) är joniserbara lipider neutrala. Den här designen kan på ett smart sätt lösa problemet med katjoniska liposomer: eftersom pH i blodcirkulationen är nära neutralt är joniserbara lipider också neutrala, och den icke-specifika bindningen mellan dem och plasmaproteiner eller blodkroppar reduceras avsevärt, vilket förlänger halveringstiden-. Dessutom, när joniserbar lipid LNP tas upp av celler och kommer in i lysosomer, joniseras lipiderna och positivt laddade i den lysosomala miljön med pH 5 -6. De positivt laddade lipiderna smälts lätt samman med endosom-lysosommembranet, vilket gör att liposomerna kan fly till cytoplasman, dissociera och frigöra nukleinsyror, och på så sätt utöva sina effekter. Sammanfattningsvis innebär design av LNP-bärarsystem optimering av lipidsammansättning, partikelstorlek, ytladdning och stabilitet för att uppnå effektiv genleverans.
LCMS-bioanalysstrategi för LNP-förpackade genläkemedel
LNP-förpackade genläkemedel består huvudsakligen av LNP-skal och själva genläkemedlet. LNP-skalet består huvudsakligen av lipidkomponenter (katjoniska/joniserbara lipider står för ca 30-50%, PEG-lipider står för ca 2%, kolesterol står för ca 20-50%, hjälpfosfolipider står för ca 10-20%), medan genläkemedel huvudsakligen består av gensekvensfragment av gensekvens, ASO, etc. och miRNA, DNA, DNA, etc.). Enligt de senaste bestämmelserna från NMPA och FDA[14-15] krävs för IND-tillämpning av läkemedel till läkemedel som LNP, förutom att utföra farmakologiska och farmakokinetiska studier på den aktiva ingrediensen (gensekvensen), säkerhets- och läkemedelsutvärdering krävs även för nya lipidkomponenter som inte har använts i marknadsförda läkemedel i läkemedelsleveranssystemet och modifierbara lipider, t.ex. i LNP.
LCMS-bioanalysen av LNP-lipider fokuserar på katjoniska/joniserbara lipider och PEG-lipider. På grund av de strukturella skillnaderna mellan dem är katjonisk/joniserbar lipidmolekylvikt i allmänhet inom 1 kDa, medan PEG-lipidmolekylvikten kan nå 2 ~ 5 kDa efter att ha burit modifieringsgrupper, vilket resulterar i stora skillnader i kromatografisk retention och masspektrometrisvar mellan dem. Med tanke på att innehållet av katjonisk/joniserbar lipid i LNP är högre än i PEG-lipid, leder svarsskillnaden till oförmågan att effektivt förena förbehandlingsmetoderna (val av extraktionslösningsmedel, bestämning av utspädningsfaktor) för båda. Dessutom, på grund av närvaron av många störande toppar runt topppositionen för PEG-lipid, krävs ofta en längre vätskefasseparationsgradient för effektiv separation, vilket inte kan garantera hög analyseffektivitet. Därför upprättar vi separat PEG-lipiddetektionsmetod i bioanalys. Samtidigt har katjonisk/joniserbar lipid och PEG-lipid också vanliga svårigheter i metodutvecklingen på grund av deras lipidkomponenter, såsom dålig löslighet i vatten, instabilitet i biologisk matris, proteinbindning till återhämtning som överskrider gränsen, hög interferens och rester av PEG-lipid, stabilitetsförändring av lipid i verklig provmatris och svårighet att välja intern standard.
