I föregående artikel diskuterade viAbsorption och distribution av oligonukleotider (ON).I den här artikeln kommer vi att fortsätta diskussionen genom att fokusera på metabolism och utsöndring av ON.
Till skillnad från småmolekylära läkemedel uppvisar oligonukleotidprodukter (ONs) minimala skillnader i metabolism mellan olika arter, med sällsynta förekomster av specifika metaboliter som endast finns hos människor eller i betydligt högre proportioner hos människor. ON metaboliseras primärt av endo- och exonukleaser, enzymer som inte visar några art-, köns- eller ålders-relaterade skillnader hos däggdjur. Detta minskar dock inte vikten av att studera metabolismen av ONs produkter. Metaboliter som finns kvar efter klyvningen av ett fåtal nukleotider kan fortfarande ha aktivitet, och endast detektering av prototyp-ONs skulle underskatta molekylens aktivitet. Dessutom kan mindre metaboliter hybridisera med sekvenser som inte är-mål, till oavsiktliga toxiska reaktioner. Därför är det avgörande att studera metabolismen av ONs.
1. In vitro metabolism stabilitet
In vitro-metabolism används vanligtvis under läkemedelsupptäcktsfasen för att bedöma stabiliteten hos kandidatmolekyler. Även om typerna av metaboliter mellan arter vanligtvis är likartade, kan metabolismhastigheterna skilja sig åt. Ett idealiskt in vitro-utvärderingssystem är avgörande för att förutsäga in vivo-stabiliteten hos produkter. Normalt föredras plasma, målvävnadsceller eller homogenat. För lokal administration rekommenderas lokala matriser.
2. Identifiering av metaboliter in vitro
Som tidigare nämnts är metabolitidentifiering in vitro avgörande för små molekyler, men för ONs är betydelsen av denna studie begränsad på grund av likheten i metabolism mellan arter. Vissa företag lämnar inte in data om metabolitidentifiering på IND-stadiet, vilket inte påverkar initieringen av kliniska prövningar. Andra, för att minska registreringsriskerna, utför inte in vitro-tester och tillhandahåller endast metabolismdata in vivo. Vissa företag tillhandahåller litteraturbaserade-bevis, som rimligen förklarar att risken att inte genomföra denna studie inte är betydande.
3. In vivo metabolism
Med tanke på de förutsägbara metabolismvägarna för ONs produkter, föreslår OSWG- och ICH-riktlinjer att tillhandahålla dessa data före kliniska fas III-prövningar.
Om inte könsskillnader i exponeringen av prototypläkemedel observeras i andraPK/TK studier, undersöks in vivo-metabolism vanligtvis i ett enda kön. Plasma- eller urinprover tas i första hand för metabolism. Plasma visar bättre överensstämmelse med vävnader, medan urin lägger till den renala metabolismen. Vävnader är också ett alternativ, med tanke på organ där ON primärt levereras eller organ som uttrycker PD-mål eller potentiellt långvarig-retention. Att undersöka metaboliter i vävnader är dock inget myndighetskrav och beror helt på företagets forskningssyfte. LC-MS används ofta för att detektera metabolism in vivo, vilket kan åtfölja toxikologiska studier.
4. Säkerhetstestning av metabolit
FDA:s riktlinjer för metaboliter kräver oro om metabolitexponeringen vid steady{0}}state överstiger 10 % av prototypläkemedlet. Detta gäller även ONs produkter.
För nya LNP-komponenter, peptider eller länkar som inte används i några godkända läkemedel måste deras säkerhet utvärderas.
5.Utsöndring
OSWG och ICH M3 rekommenderar att man tillhandahåller utsöndringsdata före kliniska fas III-prövningar. Utsöndringsvägarna för liknande ON är lika. De flesta ON metaboliseras huvudsakligen i vävnader, med endast en liten del utsöndras som prototypläkemedlet.
Utsöndring kan undersökas i separata farmakokinetiska studier eller i samband med toxikologiska studier.Engångs-dosadministrationi en enda art är vanligtvis tillräckligt. Gnagare är ofta att föredra. Både prototypläkemedel och metaboliter bör testas. Enstaka-dosnivåer vid kliniskt avsedda doser är vanligtvis adekvata, men om vävnadsfördelning bedöms kan en högre dos behövas. Vanligtvis behöver endast urinkomponenter testas. Men om urin inte är den primära utsöndringsvägen, bör andra prover såsom galla tas. Om gastrointestinal eller pulmonell toxicitet uppstår, rekommenderas ytterligare provtagning från avföring och utandning.
Även om radiomärkning inte är obligatorisk av tillsynsmyndigheter, använder de flesta marknadsförda ON denna metod för att bedöma materialbalansen. OSWG anser dock att ONs metabolism och utsöndring redan har tillräckliga forskningsdata, och likheten mellan liknande produkter garanterar inte ytterligare värde från radiomärkning. Vidare, om radiomärkning används kan den inte utföras tillsammans med toxikologiska studier. För fall där andra metoder saknar känslighet, eller för nya typer av ONs-produkter, eller för vävnader med förlängda retentionstider som hindrar kliniska studier baserade på radiomärkt utsöndring, har radiomärkning hos djur viss betydelse. Som tidigare nämnts, om radiomärkning används, bör märkningspositionen företrädesvis vara i regioner som är stabila mot nukleaser.
Bröstmjölkssekretion beror på produktens exponeringsnivå och varaktighet, oral biotillgänglighet och om målpopulationen inkluderar ammande kvinnor. Enligt ICH S5(R3) är denna studie i allmänhet inte nödvändig. Resultat från studier av bröstmjölksutsöndring som utförts på marknadsförda ONs-produkter har visat mycket låga koncentrationer eller var oupptäckbara.
Dessutom, i likhet med kraven för absorption, distribution och metabolism, om konjugat eller formuleringar innehåller nya komponenter förutom ON, bör deras detektion läggas till utsöndringstest. Slutligen, för mRNA-terapiprodukter, på grund av deras inneboende instabilitet, krävs inte utsöndringsstudier.
6. In vitro läkemedelsinteraktioner
DDI involverar främst metaboliska enzymer och transportörer. En drog kan agera som ett "offer" eller som en "förövare" som påverkar andra drogers PK. Ur offrets perspektiv måste ON vara substrat för fas I eller II metaboliska enzymer eller transportörer. Emellertid genomgår ON primärt metabolism via nukleaser och är inte relaterade till CYPs metaboliska enzymer eller transportörer. Dessutom påverkar ON vanligtvis inte bindning av plasmaproteiner av små molekyler. Därför kräver ONs produkter vanligtvis inte relevanta studier som substrat för metaboliska enzymer eller transportörer. Men för konjugerade ON- eller LNP-formuleringar med nya komponenter kan enzymsubstratstudier övervägas. För ONs som primärt utsöndras via njurarna kan utvärdering av om de är substrat för njurtransportörer bedömas. För GalNAc-konjugerade ONs-produkter bör uppmärksamhet fästas vid om de är substrat för hepatiska effluxtransportörer.
Ur förövarens perspektiv har ON verkligen potentialen att ospecifikt binda till vissa stora molekyler, om än med svag affinitet, kan de fortfarande ockupera aktiva platser för enzymer eller transportörer, vilket påverkar PK för andra läkemedel. Inte bara ONs struktur utan även konjugerade komponenter eller formuleringskomponenter utgör potentiella risker. Om en produkt utvecklas med plattformsteknik kan DDI-bakgrundsdata refereras. Till exempel, om en prekursorprodukt visar positiv DDI, behöver även efterföljande produkter som är designade utifrån plattformen relevanta studier. Om det är negativt kan andra produktdata och litteratur tillhandahållas utan behov av ytterligare DDI-studier. Dessutom bedömer DDI vanligtvis testmaterialet i full-längd, med metaboliter som inte ingår i undersökningens omfattning. Eftersom endast en liten del av ON flyr från lysosomer och kommer in i cytoplasman efter cellulärt upptag, vilket påverkar metaboliska enzymer, simulerar hepatocyter bättre hela denna process, medan falska positiva är mer sannolikt med levermikrosomer. Om man tittar på transportörer kan marknadsförda ON verkligen hämma vissa transportörer, såsom casimersen som hämmar MATE1 och eteplirsen som hämmar OCT1 och OATP1B1. Därför är det tillrådligt att genomföra studier om hämning av utflöde och inflödestransportörer av ON.
Förutom att direkt orsaka DDI genom bindning, kan ONs också påverka uttrycket av CYP eller transportörer genom deras PD-effekter. Därför behövs grundlig litteraturforskning för att bedöma effekten av den avsedda produktens PD-effekter på uttrycket av metaboliska enzymer och transportörer. FDA är också oroad över ON som indirekt påverkar CYPs aktivitet. Till exempel kan cytokiner påverka CYPs uttryck, och ON kan reglera cytokinkoncentrationer. I sådana fall är standardmetoder för in vitro CYP-utvärdering inte tillämpliga, och utvärdering med patientplasma efter administrering i hepatocyter kan övervägas.
FDA (2020) och EMA (2012) riktlinjer föreslår att DDI-studier för småmolekylära läkemedel ska slutföras före kliniska fas III-prövningar, vilket även gäller ONs produkter.
7. Slutsats
Oligonukleotidläkemedel tillhör en relativt ny kategori av läkemedel, och det finns inga specifika riktlinjer för ADME-studier för denna klass av produkter. Industriföreningar som OSWG har spelat en betydande roll i att tillhandahålla detaljerade rekommendationer för ADME-studier. Medan de flesta principer för utformning av tester för oligonukleotidläkemedel liknar traditionella små molekyler och biologiska läkemedel, har de sina egna specificiteter. Till exempel är risken för könsskillnader i absorption relativt låg, vilket möjliggör PK-studier av enstaka-arter. Insamling av biologiska prover bör ta hänsyn till halveringstiden- i vävnader. Studier av vävnadsfördelning för oligonukleotidläkemedel är avgörande och kräver tidigare milstolpar än traditionella små molekyler och biologiska läkemedel. Dessutom, på grund av konsistensen av metaboliska enzymer över arter, är betydelsen av oligonukleotidläkemedelsmetabolismstudier inte lika hög som för små molekyler. Oligonukleotidläkemedel är vanligtvis inte substrat för leverenzymer som CYP, men de kan verkligen påverka aktiviteten hos CYP:er eller transportörer, vilket kräver uppmärksamhet på DDI-risker. Alla studier behöver dock inte slutföras innan IND; många prövningar kan tillhandahållas under kliniska prövningar. Oligonukleotidprodukter innebär också risker som introduceras av konjugerade komponenter, leveransvehikelkomponenter, etc., som bör övervägas noggrant vid studiedesign eftersom de kan påverka detektionsparametrar.
